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农药残留的酶活性抑制与免疫分析技术的免疫分析法(四)

时间:2019-01-28 19:42:11 来源:凤凰彩票网 作者:匿名



2反应介质中的电解质:电解质是抗原 - 抗体反应系统中不可缺少的成分,可引起免疫复合物的可见沉淀或凝集。通常,8.5g/L NaCl溶液用作抗原和抗体的稀释剂和反应介质,并且可以根据需要选择更复杂的缓冲液。如果反应体系中的电解质浓度低或甚至不存在,则抗原 - 抗体不太可能显示出可见的反应,并且特别难以形成沉淀反应。如果电解质浓度太高,将发生非特异性蛋白质沉淀。

3反应温度:温度对免疫反应的影响是显而易见的。如果温度太高,生物分子将变性。如果温度太低,生物分子的活性将降低或丧失。除了上述极端条件。抗原 - 抗体具有相对高的温度适应性,通常通常可在15至40℃的范围内进行。在此范围内,温度的变化主要影响反应速率并且对反应的影响较小。抗原 - 抗体反应的最适温度为37℃。

4应该是时间:时间本身不会主动影响抗原 - 抗体反应,但实验期间观察的时间可能会看到不同的结果。时间因素主要由反应速率反映,反应速度取决于诸如抗原 - 抗体亲和力,反应类型,反应介质,反应温度和反应模式等因素。通常,固液两相免疫反应达到平衡的时间为1至3小时。在优化条件或反应启动子下,可以缩短免疫应答达到平衡的时间。同质免疫应答比异质免疫应答达到更快的平衡,并且通常在37℃下平衡15分钟。

第二,免疫测定的类型

免疫测定有许多不同的分类方法。根据抗原 - 抗体反应是在固液两相还是在单液相中进行,是否需要进行固液分离,可分为非均相免疫分析和均相免疫分析;根据抗原 - 抗体结合反应的方式,免疫分析可分为非竞争性免疫分析和竞争性免疫分析;标记免疫测定和非标记免疫测定可根据抗原(或抗体)是否被标记进行分类。

(1)异种免疫测定

非均相免疫测定通常在固相和液相中进行。用适当的标记标记抗体或抗原,将抗原或抗体固定在合适的固相载体(如聚苯乙烯微孔板)的表面上,同时在抗原 - 抗体反应中在液相中呈现游离标记和固相系统。绑定标签,两个相位标记都是活动的。在反应平衡后,分离固相和液相,测量固相上的标记物在固相上的活性或液相中游离标记物的活性,以及??分析物的含量。估计。酶联免疫吸附测定(ELISA)是目前最常用的异质免疫测定法。该测定有三种必需试剂:1层抗原或固相抗体,即免疫吸附剂; 2酶标记的抗原或抗体,称为酶结合物。3酶底物和显色剂。酶联免疫吸附测定可用于测定抗原以及测量抗体。由于抗原 - 抗体反应在两相之间进行,反应需要很长时间才能达到平衡,并且在反应平衡后,需要进行两相分离,因此检测速度慢。

(二)同源免疫分析

均相免疫测定在均相系统中进行(通常在液相中)。如果抗体或抗原可以用适当的标记(例如酶,荧光剂等)标记,则标记的活性(例如酶活性)被抑制或其他信号改变(例如荧光偏振,荧光) )抗原 - 抗体反应形成复合物后。增强,荧光猝灭等)检测抗体或抗原,反应后不需要分离结合标记和游离标记,直接确定系统中标记的活性或相关信号的变化来确定结合或free标记的数量,从而获得关于待测抗原或抗体含量的信息。均相免疫测定不仅可用于测定大分子抗原或抗体(如蛋白质),还可用于测定小分子化合物,如杀虫剂,药物,激素,药物和兴奋剂。均匀免疫反应达到快速平衡,不需要两相分离。该方法简单快速。

(3)非竞争性免疫测定

非竞争性免疫分析主要包括双抗体夹心法,间接法和捕获包被法。

1.通过双抗体夹心法检测抗原大抗原如病毒抗原和蛋白质通常具有多种抗原决定簇。为了检测这些抗原,经常使用针对不同抗原决定簇的双抗体夹心法。用于抗原检测的双抗体夹心测定原理如图6-5所示。检测程序如下。

1将特异性抗体包被在固相载体上。通过洗涤除去游离抗体和杂质以阻断固相上未结合的抗体的位点。

2将待测抗原在37℃温育,将样品中的抗原与固相抗体合并,形成固相抗原抗体复合物,洗去并除去未结合的游离物质。

3添加针对另一种抗原决定簇的酶标抗体,并在37°C下孵育。固相上的抗原 - 抗体复合物与酶标记的抗体结合,形成抗体 - 抗原 - 抗体 - 标记的抗体三元复合物。彻底清洗以去除未结合的酶标记的抗体。此时,与固相结合的酶标抗体的量与样品中待测抗原的量正相关。4酶添加底物和显色剂,固相三元复合物上的酶催化显色剂产生有色产物,样品中抗原的量与酶促显色强度成正比,抗原可通过比色测定。定性分析和定量分析。

在实际应用中,例如抗体来源是抗血清,用于包被和酶标记的抗体优选来自不同物种的动物。例如,当使用单克隆抗体时,选择针对抗原上不同决定簇的单克隆抗体用于包被固相和分别制备酶标记的抗体。这种双抗体夹心法具有很强的特异性,可以将测试样品和酶标记的抗体一起温育进行一步检测。

2.间接方法检测间接检测抗体的原理如图6-6所示。用抗原包被固相,加入待测样品和酶标记的二抗,待测抗体与固相抗原结合,酶标记的二抗与抗体结合。待测抗体,通过检测酶标记的二抗检测酶促显色反应。要测试的抗体。间接检测抗体的方法如下。

1将特异性抗原包被在固相上。洗涤去除未结合的抗原和杂质。

2加入待测样品,在37°C下孵育。待在样品中测试的抗体与固相抗原结合以形成抗原 - 抗体复合物。洗涤可去除样品中的其他自由组分。

3酶标记的第二抗体,将与固相抗原结合的待测抗体与酶标记的第二抗体组合。洗净去除释放。

4酶和彩色显影剂的底物着色,与固相结合的酶标记的二抗的量(酶促显色反应强度)与样品中待测抗体的量正相关。 。

参考:农药残留分析

相关链接:

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(I)

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(II)

农药残留酶活性的抑制及免疫分析技术的免疫分析(III)

[关键词]农药残留,酶活性抑制,免疫分析,国家标准物质网络

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